【First-in-class药设系列】"变构-正构"抑制剂联用克服慢性粒细胞白血病耐药
在慢性粒细胞白血病（CML）和费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞型白血病中，BCR-ABL1点突变介导的对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的耐药性可通过几种已被批准的药物有效控制住，这其中包括用于治疗BCR-ABL1 T315I突变的普纳替尼（ponatinib）。但是在对产生TKI耐药性的患者的活组织检测结果表明，复合突变是使得肿瘤对目前大多数TKI脱敏的主要原因，对于携带复合突变的患者，目前治疗的选择性还非常有限。近日，美国犹他大学研究人员合作在Cancer Cell上发表论文，将变构抑制剂asciminib (ABL001)与普纳替尼联用可提高对BCR-ABL1复合突变体的抑制效率，为耐药的CML患者提供了一个新的治疗方案1。ABL001是一种针对BCR-ABL1肉豆蔻酰基结合口袋的变构抑制剂，对大多数单一突变体都有活性，但对所有被测的复合突变体都无效。研究人员表明，采用“变构-正构”联用策略，ABL001与ATP竞争型TKIs联用可以增强对携带有高耐药性复合突变体Ph+临床分离株和细胞系的抑制作用，该结果支持将ABL001和普纳替尼结合作为治疗高耐药性白血病患者的有效策略。
首先，研究人员在体外利用原发性CML病人的细胞系，对ABL001的活性进行了首次评估。CRKL是临床上指征BCR-ABL1信号通路活性的重要标记物。荧光激活细胞分选和免疫印迹分析结果显示，经ABL001处理后，CML细胞中的CRKL磷酸化水平呈浓度依赖性降低。此外，在有健康细胞系做对照的情况下，ABL001选择性的抑制了原始CML细胞系的克隆生成和人类Ph+白血病细胞系的增殖。以上这些结果说明，ABL001可以有效地阻断BCR-ABL1介导的信号通路，并选择性地抑制BCR-ABL1阳性细胞的生长。
接下来，研究人员利用能表达BCR-ABL1及BCR-ABL1突变的Ba/F3细胞系，研究了ABL001对能引起ATP竞争型TKIs耐药性的点突变的敏感性。研究人员先通过实验确定，ABL001能强有力地抑制表达了BCR-ABL1的Ba/F3细胞系的生长，并且能够降低这些细胞系中BCR-ABL的自我磷酸化以及下游靶标STAT5的酪氨酸磷酸化水平；然后他们通过Ba/F3细胞系表达了位于BCR-ABL1不同结构域的10个点突变并对它们进行ABL001处理后发现，ABL001能够有效抑制BCR-ABL1上的G250E、 Y253H、E255V、T315I和 H396R这几个突变，但对第359位苯丙氨酸的突变没有作用。免疫印迹实验结果再次证实了ABL001对能引起ATP竞争型TKIs耐药性的单点突变的敏感性。
随后，研究人员采用基于细胞的加速诱变筛选技术来探索了ABL001与ATP竞争型TKIs联用后对BCR-ABL1点突变的抑制作用。研究人员通过实验发现，单用ABL001处理耐药性克隆时，耐药性克隆的生长呈浓度梯度下降，最后在耐药性克隆中只能找到存在于肉豆蔻酰结合口袋里面或周围的三个点突变，这些突变的存在提示ABL001与BCR-ABL1的结合受损。将ABL001与尼罗替尼联用后可以看到，与ABL001或尼罗替尼单种药物的作用相比，两种药联用明显降低了耐药性克隆的生长量，在耐药性克隆中能找到的突变都是在临床上对尼罗替尼存在耐药性的点突变。而将ABL001与普纳替尼联用后，效果比与尼罗替尼联用时还要好，在耐药性克隆里都找不到突变体的存在。这说明，ABL001与普纳替尼或尼罗替尼联用，能够有效抑制BCR-ABL1点突变引起的耐药性的出现。
ABL001对BCR-ABL1上能引起TKI耐药性的单点突变具有不同的敏感性。那TKI对能引起ABL001耐药性的突变的敏感性又如何呢？研究人员也进行了相应的分析。实验结果表明：虽然位于肉豆蔻酰结合口袋里面的4个突变（A344P, A337V, P465S和V468F）对ABL001具有高度耐药性，但这些突变依旧保持了对ATP竞争型TKI的敏感性。
ABL001对引起ATP竞争型TKIs耐药性的大多数点突变有不同程度的敏感性，但对第359位的苯丙氨酸突变无效，说明该突变可能是引起临床上ABL001耐药性的一个原因。研究人员通过监测多个处于慢性期CML的病人样本中的多个突变的动态变化时发现，这些病人在用ATP竞争型的TKI药物治疗失败之后给予ABL001处理后，绝大多数的突变包括T315I都逐渐消失了，除了第359位苯丙氨酸的突变。体外实验也可以看到，用ABL001和伊马替尼分别处理能表达第359位苯丙氨酸突变的Ba/F3细胞后，伊马替尼处理组能明显看到该细胞的BCR-ABL1的自我磷酸化水平受到了抑制，而这种抑制作用在ABL001处理组中并未观察到，由此进一步证实了ABL001对第359位苯丙氨酸的突变的不敏感性，第359位苯丙氨酸的突变是引起临床对ABL001耐药性的一个原因，但具体的耐药机制还有待于进一步研究。
研究人员通过测定药物处理原代CML细胞系后细胞的CRKL的磷酸化水平以及克隆生成发现，将ABL001与普纳替尼或尼罗替尼联用后，能够加强对BCR-ABL1信号通路和CML细胞生长的抑制作用，这为清除原带CML细胞提供了一种有效的治疗措施。
ABL001以及ABL001与普纳替尼等结合后对BCR-ABL1点突变有一定的抑制作用，那么它们对BCR-ABL1复合突变的抑制效果又会是怎样的呢？研究人员通过深入的分析发现，单用ABL001时，所有被检测的复合突变都表现了对ABL001的耐药性；单用普纳替尼时，普钠替尼对所有含T315I的复合突变无效，对部分不含T315I的复合突变具有不同程度的敏感性。将这两种药物联用时，IC50值相比于单种药物时，有明显的下降，说明这些复合突变对药物的敏感性有了很大的提高。T315M、 Y253H/T315I和E255V/T315I 是临床上对普纳替尼具有最强耐药性的三种复合突变。单用ABL001或普纳替尼对这三种突变都没有效果，然而将这两种药联用之后，可以看到药物对这三种突变具有很好的敏感性。这样的药物联用组合可以为临床上含有这些复合突变但目前又没有有效TKI的患者提供一种治疗方案。
通过前面的体外实验，我们可以清楚的看到，ABL001和普纳替尼联用能够有效的抑制BCR-ABL1复合突变的出现并恢复对这些突变的药物有效性。研究人员后续对这些现象进行了体内实验验证。他们先将表达有BCR-ABL1t315I/H396R复合突变的Ba/F3细胞系通过尾静脉注射注入到非肥胖的严重糖尿病加免疫缺陷型小鼠体内，然后培养三天，再对每组小鼠给与载体、普纳替尼、ABL001以及两种联用处理19天，之后发现，两种药物联用处理的小鼠组的寿命是所有组里最长的，并且这组小鼠相对于其他组小鼠而言，体内的肿瘤负荷是最小的，体重下降幅度也是最低的，由此说明ABL001与普纳替尼联用能够延长携带含有T315I在内的复合突变的CML小鼠的寿命，并且能有效的抑制小鼠体内肿瘤组织的生长。
最后，研究人员通过对ABL1激酶区域进行分子动力学模拟和对接分析来探索了ABL001与普纳替尼结合能够对Y253/T315I复合突变体有效而ABL001或普纳替尼单种药作用时无效的作用机制。基于分子动力学的结构模型提示：Y253/T315I复合突变主要存在于催化活性构象中, 此时ABL1激酶结构域的aI螺旋是直的而不是弯的，从而干扰了SH2/SH3与c端的相互作用，阻止了肉豆蔻酰结合口袋的生成。此外，与天然的ABL1激酶结构域相比，Y253H/T315I突变体在选择的结构基序中表现出更大的流动性，最显著的是C螺旋处和激酶结构域的激活环上的残基。然而，当与普纳替尼结合时，这种运动得到大大的缓解，从而稳定了对ABL001敏感的构象。最后，研究人员根据他们的分析结果，对联合用药有效抑制Y253H/T315I这种复合突变的机制提出了一个假设。他们认为，尽管BCR-ABL1Y253H/T315I对普纳替尼耐药，但普纳替尼可短暂性占据活性位点，诱导构象从活性状态向非活性状态转变。这种构象的改变大大降低了肉豆蔻酰结合袋的灵活性，使其能够组装并与ABL001相结合。反过来，与ABL001的结合预计将导致进一步的、持续稳定的普纳替尼结合和BCR-ABL1激酶结构域的非活性构象，最终导致强有力的激酶抑制。不过，研究人员称，这个假设可能还需要后期通过更多的晶体结构分析和生化试验来进行验证
变构药物的发现为当前困扰临床肿瘤治疗中的耐药问题提供了极具前景的解决方案。本文中针对BCR-ABL1的"变构-正构"药物(ABL001与普纳替尼)联用，系统地解决了因复合突变造成的耐药性问题，并且大大降低了临床所需的普纳替尼浓度，减少了副作用，不仅为携带BCR-ABL1复合突变体的白血病患者提供了一种有效的治疗策略，也为更多耐药靶标的药物发现开辟了变构思路。
参考文献
Christopher A. Eide et al. Combining the AllostericInhibitor Asciminib with Ponatinib Suppresses Emergence of and RestoresEfficacy Against Highly Resistant BCR-ABL1 Mutants. 2019, Cancer Cell, 36(4): 431–443.e5.